用微过滤的方式进行酶细胞分离的好处 |
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Robert J. Keefe
David M. Dubbin,
生物处理工程的进步已经彻底改革了许多生物化学产品的商业生产，尤其是工业酶。日用品和专用酶的酶工业，以有效速率增长，因此压力产生以改善生产效率和生产经济，并改善用于生产酶的净化处理步骤。 典型生产使用了基因修正有机体的发酵，在生产细胞和净化已经过离心过滤的酶中使用的传统恢复方法，要参照涂料层过滤法。交流膜过滤，尤其是微过滤，已日益用于更换这些分离步骤的任何一个或者全部，这是由于低投入的操作花费，更高的酶产量，以及后期处理方法。 这个文件将详细描述微处理是如何用于首选的细胞生产步骤，略述潜在的经济利益以及程序需求。 酶工业酶是有效化合物，极大地提高了生化反应的速度和效率，但不改变根本程序。传统上，工业酶的使用已经在某种程度上受限制，由于对周围环境的高敏感度（pH，温度，湿度，污染物）以及储存局限性。这些缺点正被复合酶的发展所克服，包括变异特效的，孤立的补充DNA链，使其药力和药效更强。蛋白质工程，分子演化和其他新的蛋白质设计工艺正在日益用于进一步精炼酶的特点和性能上。 酶，有时候作为生物催化作用时，通过增加传统的化学介质的效力或甚至替换传统的化学介质，从而改善其反应，在此方面有巨大的潜能。酶比传统的化学物质更为经济，在环保方面也更安全。因此，公司正在进行实体研究的投资，以及在基因修正细胞方面的发展努力，以生产高度聚焦的酶。今天使用的最普通的就是用于清洁剂（去污），纺织品（抗皱性），乙醇和皮革，但是潜在的应用性可能数以千计。 虽然在生物处理工程上的进步跟随着很多应用方面上的酶的工程化，目前少于30的酶占90％以上的工业使用。预计，随着小生境和专业酶的数量的增加会改变这一情况。例如，在动物饲养方面的植物酶的使用。市场以健康步骤发展，新型酶的广泛使用对这一发展有重要贡献。2003年的工业酶的全世界销售已经超过二十亿美元。 分离工艺新型酶的发展为新型改良回收和分离程序带来了机会。现在科学和工艺的存在为了生产这些高度特效酶。现在的关键挑战之一就是精炼并最优化酶的生产，以使他们的生产更为有效经济地鼓励使用的发展。 细胞DNA的基因修正，无论是植入或者修正一定的特性，科学家利用三种主要的有机体类型：细菌（假单胞菌是一种普通链），酵母或真菌组织，与用于药品生产上的哺乳动物细胞相对。所有均使用发酵工艺以繁殖细胞。酶是典型的，但不是普遍的，细胞外的，意味着他们生长并且在细胞外表现。由于细胞完整无缺，细胞外面有酶，自然分离被要求复原从发酵液中分离出的酶。这比提取细胞化合物更为简易。必须首先弄破细胞，创造多种型号以及特性因素的混合物。 微过滤使用陶瓷膜，正在迅速成为细胞分离的工艺选择，当酶被允许通过的时候，抑制整个细胞，在扩散流中提取出来。这是传统分离工艺的经济可行的替代品，诸如离心和旋转真空过滤法。使用更简便的膜过滤程序，以提取细胞，允许生物工艺伴随简化经济的能力。 生物工艺中，主要的细胞分离的常规方法或者是离心过滤法，或者是旋转鼓真空过滤法，用压力叶轮过滤器来去掉少量残余的细胞残骸。一旦被分离，酶就用超滤作用被浓缩和净化。这是在结束和成形以前，一个在工业中使用多年的标准处理过程。 离心过滤法有大量缺点，例如高保养成本，热产品，蛋白质变性，但是最明显的不完整分离是由于取决于密度的快速离心过滤法，而不是不同的大小。旋转鼓真空过滤器以及其他已废弃的过滤工艺也有缺点，最显著的方面是收得率损失。 现代的方法是使用交流膜过滤法，以及显著的微过滤法。微过滤法比常规工艺更重要的一些优点是：
图1显示了带微过滤的常规分离流程的替代品。
微过滤的执行可能有所不同，这取决于一个酶的生产者是否进入一个全新的流水生产线，或转变/改良现存的流程。对于一个新的系统来说，使用微过滤来代替离心过滤和滤料层过滤程序更为经济。改良一个现存系统，仅更换滤料层过滤器以及把离心分离机留在适当的位置上更为合适，如果没有保养问题。
为了评估和定义酶的微过滤分离流程的特殊操作情况，以确保商业范围的成功，流程和设备设计和导向检测都至关紧要。关键是正确设计和操作微过滤系统，以确保获得最高可能资本来减少资本耗费，最高的酶渗透性，或通过膜的酶的通道，已使产量和回收最大化。图2显示了一个典型的商业化微过滤系统。 成功设计一个酶回收的微过滤系统，其最大的挑战是达到最高的通过膜的酶渗透性。对于保证良好的酶渗透性来说，控制膜表面的界面层是至关重要的。这必须保持在一个绝对的最小值，以确保膜自身进行分离，而不是界面层。从一个设计的角度，在膜线路范围内，交流速率有助于促进紊乱，控制正确的转换膜压力，这对于完成这一过程非常重要。 关键的膜系统设计因素为了使微过滤系统有效地操作，有大量与之相联系的不同的技术因素影响了设计和微过滤系统的全部性能。 成批生产与连续生产相对可能要决定的第一个设计因素是对于操作批量生产或连续生产的操作模式的选择。较之细胞种植的连续生产，尤其是发酵液（尤其是粘性）的特性在自然里千变万化，一个批量生产工厂通常是一个更为灵活的解决方法。在进行少量处理时，推荐的解决办法是，在一或两个循环线内安置工厂，以及膜范围量不大。 要处理更大的肉汤量时，需要由五个或五个以上的循环圈组成的组织结构，有充分的操作要点已使在膜区域的连续生产更为有效，更可供比较，因此是可行的。连续操作的优点包括最小的滞留时间已使退化最小化，使每个阶段的最优化达到最小化以与预期粘性相配，以及使需要的膜区域最小化。完全过滤，是水，黄油，酒精或溶剂的附加物，以改进特殊化合物的回收，它可以在每个循环圈范围内自动调节，从而使控制最优化。 无论如何，如果浓度过大可以避免，在维持设计循环率的最大压力落差方面，控制系统有着迫切的需要。微过滤生产工厂是典型设计用于进行低操作压，以及每个元素约15psi的压力落差。由于较高的能量耗费，与所需更大的马力相关，一个更高的压力落差可能削弱经济，并可能安置特性。 膜类型的选择
经验显示陶瓷膜（图3）理想用于酶回收。根据整个细胞肉汤的处理过程中潜在的高粘性和高细胞密度，使用陶瓷膜，这是由于开放，管状的路线（和聚合螺线管相比，它的线路很狭窄）。开放线路的配置，以3，4，6mm为直径的线路为代表，能轻易处理整个细胞肉汤无需用悬浮固体塞紧。另外，陶瓷膜清洁，能当场清洗或用蒸汽杀菌。它们是多年来由FDA认证的清洁膜，商业可行及技术可能的。 在检测过程中，基本因素即选择正确的膜来分离细胞。使渗透性最大化将达到高产量以及高萃取率，而使完全过滤液的需求最小化，则无需浓缩这一步骤。分离要求膜上的孔的大小足够酶通过。孔的分布是重要的，取决于酶分子的形状。其他影响分离的因素是膜，对流力以及电子力的表面电荷。 表面特性: 膜本身相关的表面电荷与酶相比较，是主要的考虑。如果两者的电量相等，膜表面可能排斥酶，极大地减少了传播，相反的电荷会吸引及潜在地改善回收。膜表面性能对于污垢的可见性也十分重要。吸水膜比不吸水膜更能够抵抗污垢。 对流力: 膜过滤是一种对流技术，但是，实际上，有两种力。切割力和膜表面平行，由交流速率产生，膜表面的垂直力由横膜压力产生。切割力形成偏振集中，或gel layer，保留材料在膜表面形成。用高压速率以及低横膜压力操作微过滤处理程序。为了进行正确操作，这些力需要进行最优化。 电力: 酶的形状和大小可随着pH值以及电荷改变，改变分离特性。进行完全过滤尤其重要，离子强度例如盐的浓度，会影响酶的渗透性，如果离子平衡性很差。蛋白质的出现也会影响膜的特性。 凝胶体层浓缩两极化的形成，或凝胶体的形成，是陶瓷微过滤分离系统错误设计的缺点。在压力下，溶剂和溶解物被迫压制到膜表面，既然这样就是酶。凝胶体层形成在膜表面上，作为二级膜作用，并且干扰分离。 凝胶体层的形成有两种方法对分离有不利的影响。首先，从中度到高度溶剂浓缩物，凝胶体层的抵抗性比膜本身的抵抗性高，有效地阻止了酶的分离。第二，如果失去了凝胶体层获得的酶，将减少整个产量。 在许多例子中，在分离预先澄清过的肉汤时，凝胶体层密度更大。肉汤中含有小的分子和其他蛋白质。整个肉汤受到的影响较小，而较大的细胞可能引起冲刷效应，将使凝胶体层最小化。在膜表面凝胶体层也受剪切率影响。 凝胶体层形成的控制陶瓷膜有能力使凝胶体层最小化，只要系统设计正确。通过控制对流力，比如（切线速率与横跨膜压力），凝胶体层可以得到控制与最小化。这一影响的典型速率是5m/s或更高。这是交流膜过滤的突出优点，它仅显示了过滤媒质上的垂直力。陶瓷膜的优点是污垢作用发生，他们可以清洗并立即放到线上。在要求进行更换以前，陶瓷膜也可以持续使用很多年，与过滤筒，及其他过滤介质相反，陶瓷膜是单独使用的。（注释——这是最后一个句子的正确位置吗？或者在技术进步下来的？） 污垢会遇到两种类型的污垢，可废弃的污垢，流量增加，减少滞留物压力；不可废弃的污垢，流量不会随着压力减少。流量必须维持在一个稳定的水平，将污垢保持在一个临界速率。污垢的速率与流量速率相关，为了控制污垢，有一个临界速率必须不可被超过。这在启动过程中尤其重要，瞬间流量会很高。MF工厂需要在横跨膜压力范围内进行操作，流量与压力成比例增加。当流量不再按比例增加时，已经超过了瞬间流量，不进行清洗则不能去掉污垢。 在设计系统时，通过导向测试来界定临界速率。在发展完善的应用过程中，有经验的工程师对于临界速率有很好的概念。然而，在新的应用中，在生物和制药范围内，导向测试是极其必要的。程序工程师关注“偏移”，以使容量最大化，使凝胶体层最小化，改变操作参数，比如温度，压力和流速直至达到临界点。一旦界定了最佳参数，接着便能确定商业系统的操作环境。 陶瓷膜的技术进步许多年来，公司尝试着设计膜系统和产品，他们将通过改善在边界层紊乱来增强系统流体力学。早期尝试的一部分，包括反向旋转的同心罐或圆盘，气球的引进，技术设备的使用，以及受脉冲作用的流体系统，穿过膜的相反的流动方向。许多系统在实验室范围内被检测，但并不证明商业上可行。 有效的微过滤系统最终在过去几年里，进入了市场，使控制渗透压力成为可能，因此平均的横跨膜压力，仅仅是切向速度，尤其是陶瓷膜最近的发展允许在整个膜表面控制横跨膜压力，因此达到了最佳可持续产品量。尝试实现这个包括：更多的永久性发展中的两个包括——在膜支持层中的可变抗体，以及活的膜层的新的可变抗体。 陶瓷膜的表面化学物质的优点允许膜倾斜的修正，以克服凝胶体层，其在敏感的分离过程（如酶回收）中极其重要。 常规的微过滤过程（图4）：传统陶瓷膜技术仅允许在宏观范围内对横跨膜压力的控制，经由供给和渗透压力的单独调整。横跨膜压力根据任何指定成分的长度变化，是由于元素的压力下降。当陶瓷元素以比许多聚合体系统更高的切向速度（达到6m/s）工作时，横跨膜压力有一个重要的变化，导致凝胶体层（尤其在入口处）的快速形成，因此限制了传播。中点产生了一个最佳状况；在元件末端，由于低于最佳横跨膜压力，则流量较低。当给料流沿着膜流动时，膜区域实际上被利用地越来越少，所以凝胶体层形成地非常快速，减少了有效使用地膜长度。
不同的工厂对系统设计或者膜自身进行了修正，以生产“受控制的倾斜膜”，这可减少凝胶体层，允许进行更多困难的分离。这会有助于维持整个元件长度的一个持续的压力下降，因此可使凝胶体的极化作用或边界层最小化。 先进的陶瓷膜：两个陶瓷膜工厂已经提出了两种不同的解决方法，以生产受控的倾斜膜，从而使凝胶体层最小化，允许发生独特的分离。两种方法都修正了膜倾斜度，有助于实现消除或使凝胶体层的形成最小化的目标。其一是有修正膜支持的层，另一种则包含了厚度可变的活性膜层。 第一种方法（图5）有一个支持层，其孔的数量随着元素长度的减少而减少，以向入口处末端的流量提供更多的抗体，并降低出口处末端的抗体量。这会有助于达到超过膜长度的统一渗透量，这通过允许更多的流质通过支持层，并进一步减少元素。这一膜在商业上使用，并被证明用于特殊例子。
第二种方法（图6）修正了膜表面自身的厚度，以调节通过膜下降的压力，在元素入口处末端变厚，出口处变薄。减少的膜厚度随着元素长度的减少而减少抗体量，以允许通过整个膜长度的持续流量。
在控制膜倾斜度中的这两种方法允许了压力与膜厚度比率的下降，最终结果成为整个元素长度的相对永久性渗透流量率。在这一永久性流率下，边界层也一直保留了目标产品的可渗透性。 结论受控倾斜膜可能不是为了每个微过滤系统过去常常有助于工业酶的回收过程。任何处理程序重要的改变，操控实验室和导向范围测试极其重要，用缩放试验工厂来确定陶瓷膜的能力，以有效地保留细胞和恢复酶…… 还有大量特定因素影响为酶使用微过滤的经济。但是，带陶瓷膜的微过滤已经证明成为一种有效的细胞种植步骤，以允许酶生产来减少程序处理成本，并改善整个酶生产程序的经济。 |
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