Преимущества применения микрофильтрации в выделении клеточных ферментов

Прогресс биотехнологии революционизировал промышленное производство многих биохимических продуктов, особенно промышленных ферментов. Производство ферментов, как продуктов широкого спроса, так и специальных, быстро растет, что создает потребность в повышении технической и экономической эффективности сбора биомассы и очистки ферментов.

Традиционный способ выделения ферментов из культуры генетически модифицированных организмов включает ступени отделения клеток центрифугированием и, затем, предварительного фильтрования. Тангенциальная мембранная фильтрация, особенно микрофильтрация, все чаще применяется взамен одной или обеих этих ступеней отделения, поскольку обеспечивает снижение инвестиционных и эксплуатационных расходов повышение выхода фермента и упрощение последующих степеней обработки.

Иллюстрация микрофильтрации

В статье идет речь о возможностях использования микрофильтрации для эффективного сбора биомассы, отмечаются как потенциальные экономические преимущества, так и технологические проблемы.

Ферменты

Промышленные ферменты – мощное средство повышения скорости и эффективности биохимических реакций без изменения базовой технологии. Прежде применение промышленных ферментов несколько ограничивалось их высокой чувствительностью к окружающей среде (pH, температура, влажность, примеси) и условиям хранения. Эти недостатки были преодолены с разработкой мощных и эффективных рекомбинантных ферментов, которые получают с помощью специфических комплементарных ДНК. Белковая инженерия, искусственная эволюция и другие новые технологии конструирования белков все шире используются для улучшения характеристик и повышения эффективности ферментов.

Ферменты, иногда называемые биокатализаторами, обладают огромными возможностями улучшения химических реакций путем повышения эффективности или даже замены традиционных химических агентов. Ферменты зачастую эффективнее и безопаснее для окружающей среды, чем традиционные химикаты. В результате компании активно работают над созданием генетически модифицированных клеток, продуцирующих специализированные ферменты. Сейчас они широко применяются в детергентах (удаление пятен), для обработки текстиля (устранение складок) и кожи, в производстве этанола, но возможных областей применения тысячи.

Хотя достижения биотехнологии позволяют конструировать ферменты для самых разных целей, в настоящее время более 90 % промышленного применения ферментов приходится менее чем на 30 их видов. Ожидается, что это переменится с увеличением числа специальных ферментов, таких как фитаза, применяющаяся в кормах. Этот рынок растет с хорошей скоростью, а расширяющийся круг применений делает значительный вклад в этот рост. Мировой объем продаж промышленных ферментов в 2003 г. превысил 2 миллиарда долларов.

Технология разделения

Разработка новых ферментов открывает возможности для новых улучшенных технологий извлечения и разделения. Сейчас существуют технологии производства этих высоко специфичных ферментов. Одна из ключевых задач состоит в оптимизации производства ферментов, чтобы сделать это производство достаточно экономичным и увеличить спрос.

Для производства рекомбинантных ферментов ученые модифицируют ДНК трех типов продуцентов: бактерий (например, псевдомонад), дрожжей, т.е. грибов, а также клеток млекопитающих (для создания фармацевтических продуктов). Затем наступает стадия выращивания этих продуцентов. Продуцируемые ферменты, как правило, но не обязательно, являются внеклеточными, т.е. выделяются клетками в окружающую среду. Поскольку ферменты находятся вне клеток, их можно отделить от культуральной жидкости физическими методами. Это проще, чем извлекать внутриклеточные ферменты, что требует разрушения клеток и последующего разделения сложной смеси компонентов с разными размерами и свойствами.

Микрофильтрация на керамических мембранах быстро становится оптимальной технологией, которая позволяет отделить от целых клеток пермеат с ферментом. Это экономичнее, чем разделение традиционными способами, например, на центрифугах или барабанных вакуум-фильтрах. Более простой способ мембранной фильтрации позволяет биотехнологическим компаниям снизить производственные расходы.

Традиционный для биотехнологии способ состоит в отделении основной массы клеток на центрифугах или барабанных вакуум-фильтрах и последующем удалении остатков клеток и клеточных обломков на пресс-фильтрах. После отделения от клеток ферменты концентрируются и очищаются посредством ультрафильтрации – процесса, который применяется биотехнологией для этих целей уже многие годы.

Центрифугирование имеет много недостатков – высокая стоимость обслуживания, выделение тепла, денатурация белка и, главное, неполное разделение, поскольку при центрифугировании оно определяется различием плотностей, а не размеров. Барабанные вакуум-фильтры и другие способы тупиковой фильтрации также имеют недостатки, главный из которых – низкий выход.

Современный подход состоит в применении тангенциальной фильтрации, особенно, микрофильтрации. Важнейшие преимущества микрофильтрации перед традиционными способами…

• Более высокая эффективность очистки ферментов, что повышает выход продукта без ущерба для биологической активности.
• Устраняется необходимость в предварительном фильтровании через диатомовую землю или перлит, а с ней вместе и проблема удаления отработанной фильтрующей среды. Также устраняется необходимость приобретения и транспортировки фильтрующей среды и соответствующие расходы.
• При тангенциальной мембранной фильтрации проходящий поток направлен вдоль мембраны, а не перпендикулярно к ней, как в фильтр-прессах. При необходимости такие фильтры легко очищаются методами безразборной мойки и стерилизации паром.
• Значительно повышается управляемость процессом и, зачастую, упрощается последующая очистка.
• И, возможно, самое важное для современной экономики преимущество – низкие инвестиционные и эксплуатационные расходы по сравнению с традиционными системами центрифугирования и тупиковой фильтрации.

На рисунке 1 иллюстрируется замена традиционного процесса разделения микрофильтрацией.

Рисунок 1. Типичный процесс сбора клеток и извлечения фермента: микрофильтрация заменяет центрифугирование и предварительное фильтрование

Реализация системы микрофильтрации зависит от того, происходит это при строительстве новой или при модернизации старой производственной линии. В новых линиях экономичнее заменить микрофильтрацией и ступень центрифугирования, и ступень предварительного фильтрования. При модернизации старой линии может оказаться предпочтительнее заменить предфильтры и оставить на месте центрифуги, при условии, что не возникает проблем с их обслуживанием.

Рисунок 2. Промышленная установка микрофильтрации

Для успешного промышленного производства ферментов необходимо предварительно разработать технологический процесс и провести пилотные испытания для определения рабочих условий микрофильтрации. Чтобы добиться максимальной производительности системы (т.е. снизить капитальные расходы), увеличить проницаемость мембран для фермента и повысить его выход, важно правильно спроектировать и эксплуатировать систему микрофильтрации. На рисунке 2 представлена типичная промышленная система микрофильтрации.

Одна из самых больших проблем при проектировании системы микрофильтрации состоит в том, как добиться максимальной проницаемости мембран для ферментов. Для хорошего проницания ферментов важно контролировать граничный слой у поверхности мембраны. Этот слой должен быть предельно узким, иначе разделение будет происходить не на мембране, а на граничном слое. Для этого важно обеспечить скорость потока, достаточную для создания турбулентности, и поддерживать надлежащее трансмембранное давление.

Принципиальные вопросы проектирования мембранных систем

Чтобы спроектировать эффективную систему микрофильтрации, требуется решить ряд взаимосвязанных технических вопросов.

Периодический или непрерывный процесс

Возможно первый вопрос, требующий решения, это выбор между непрерывным и периодическим процессом. Установка периодического действия часто удобнее для сбора биомассы, особенно при меняющихся характеристиках ферментационного бульона (таких как вязкость). Такой выбор рекомендуется для установок малой производительности с одним или двумя контурами циркуляции и небольшой площадью мембраны.

Для обработки больших объемов бульона, требующей пяти или большего числа контуров, целесообразно спроектировать установку непрерывного действия, в которой поверхность мембраны используется более эффективно. К преимуществам непрерывного режима относятся минимальное время обработки и, соответственно, минимальная деградация продукта, возможность оптимизации каждой ступени согласно ожидаемой вязкости, минимизация площади мембраны. Диафильтрация, т.е. фильтрация, в ходе которой для лучшего извлечения целевого компонента исходная смесь разбавляется водой, буферным раствором, спиртом или другим растворителем, может автоматическим регулироваться в каждом контуре.

При этом, однако, система управления должна точно поддерживать максимальное падение давления при заданной скорости циркуляции, чтобы избежать избыточного концентрирования. Установки микрофильтрации обычно рассчитаны на низкое рабочее давлении, его падение составляет приблизительно 15 psi (100 кПа) на элемент. Более высокое давление может ухудшить экономичность (из-за большей потребляемой мощности) и производительность установки.

Рисунок 3. Керамические мембранные элементы и корпуса

Выбор типа мембраны

Опыт показывает, что керамические мембраны (рисунок 3) идеально подходят для извлечения белка. Открытые трубчатые каналы керамических мембран (в отличие от узких каналов полимерных рулонных мембран) дают преимущество при обработке обладающих высокой вязкостью ферментационных бульонов с цельными клетками. Конфигурация с открытыми каналами диаметром, как правило, 3, 4 или 6 мм, позволяет обрабатывать бульон с цельными клетками без забивания мембран взвешенными частицами. Кроме того, керамические мембраны отвечают высоким санитарным требованиям, допуская безразборную мойку и стерилизацию паром. Их соответствие санитарным требованиям подтверждено FDA, они применяются уже многие годы, широко доступны и высокоэффективны.

Большое значение для успешного отделения клеток имеет правильный выбор мембраны. Максимальная проницаемость увеличит выход целевого продукта и сократит расход воды на диафильтрацию, т.е. облегчит последующее концентрирование. Поры мембраны должны быть достаточно крупными, чтобы через них проходили молекулы фермента. Распределение пор также может иметь значение – это зависит от формы молекул фермента. Другие влияющие на разделение факторы – это поверхностный заряд мембраны, конвекция и электростатические заряды.

Свойства поверхности: В первую очередь следует учесть поверхностный заряд мембраны и заряд фермента. Если оба имеют одинаковый знак, фермент может отталкиваться от мембраны, что значительно снижает проницаемость, тогда как противоположные заряды могут улучшить выход продукта. Поверхностные свойства существенно влияют и на забивание мембраны. Гидрофильные мембраны гораздо устойчивее к забиванию, чем гидрофобные.

Конвективные силы При тангенциальной мембранной фильтрации действуют две силы: параллельная поверхности мембраны сдвигающая сила, обусловленная скоростью проходящего потока, и перпендикулярно направленная сила, созданная трансмембранным давлением. Именно перпендикулярная поверхности сила создает концентрационную поляризацию – повышение концентрации ретентата у поверхности мембраны. Микрофильтрацию следует вести при высокой скорости проходящего потока и малом трансмембранном давлении, конвективные силы должны быть оптимизированы.

Электростатические силы Размер и форма молекул фермента могут изменяться с изменением pH и заряда, влияя на характеристики разделения. Это особенно важно при диафильтрации – необходимо соблюдать ионный баланс, т.к. ионная сила, обусловленная концентрацией соли, может влиять на проницаемость фермента. Присутствие других белков тоже способно повлиять на эффективность разделения.

Гелевый слой

Неправильное проектирование системы микрофильтрации с керамическими мембранами может привести к образованию гелевого слоя, т.е. к концентрационной поляризации. Перепад давления приводит к тому, что задержанные молекулы растворенного вещества, в данном случае фермента, накапливаются у поверхности мембраны. Образовавшийся на поверхности мембраны гелевый слой действует как вторичная мембрана и мешает разделению.

Гелевый слой отрицательно влияет на разделение по двум причинам. Во-первых, при средней и высокой концентрации раствора сопротивление гелевого слоя может даже превышать сопротивление мембраны, существенно ухудшая извлечение фермента. Во-вторых, задержка фермента в гелевом слое означает потери, т.е. снижение выхода.

Во многих случаях гелевый слой оказывается более плотным при разделении предварительно осветленного бульона, который содержит другие белки и небольшие молекулы. Бульон с цельными клетками доставляет меньше таких проблем, крупные клетки могут оказывать эрозионное действие, уменьшая толщину гелевого слоя. На гелевый слой влияет также скорость сдвига у поверхности мембраны.

Противодействие образованию гелевого слоя

Правильно спроектированные системы с керамическими мембранами позволяют минимизировать формирование гелевого слоя. Регулирование тангенциальной скорости и трансмембранного давления позволяет добиться минимальной толщины гелевого слоя. Как правило, для этого требуется скорость 5 м/с или выше. В этом состоит важнейшее преимущество тангенциальной фильтрации перед тупиковой, в которой действуют только силы, перпендикулярные мембране. Достоинство керамических мембран состоит в том, что забившиеся мембраны можно очистить и вернуть в систему. Керамические мембраны могут работать многие годы, в отличие от фильтрующих элементов и других одноразовых фильтрующих сред.

Засорение

Можно выделить два типа засорения мембран – обратимое, при котором скорость фильтрации меняется вместе с давлением ретентата, и необратимое, при котором скорость фильтрации не восстанавливается после снижения давления. Скорость фильтрации необходимо поддерживать на устойчивом уровне, не допуская чрезмерного засорения. Скорость засорения связана со скоростью фильтрации, во избежание засорения нельзя превышать критическую скорость фильтрации. Это особенно важно при пуске установки, когда мгновенная скорость фильтрации может быть весьма высоким. Обычно МФ установка должна работать в диапазоне трансмембранных давлений, в которых скорость фильтрации пропорциональна давлению. При скорости фильтрации выше критической, когда пропорциональная зависимость от давления нарушается, засорение становится необратимым.

При проектировании системы важно на пилотной установке определить критическую скорость фильтрации. В хорошо освоенных областях опытные инженеры довольно точно представляют себе, какой окажется критическая скорость. Однако при решении новых задач, особенно в биотехнологии и фармацевтике, пилотные испытания обязательны. Технологи исследуют пределы рабочих параметров, таких как температура, давление и скорость потока, чтобы достичь критической скорости и добиться максимальной производительности и минимального гелевого слоя. Найденные оптимальные параметры становятся расчетными для проектируемой промышленной установки.

Прогресс технологии керамических мембран

Многие годы различные компании пытались найти решение, позволяющее улучшить гидродинамические характеристики мембранных систем за счет турбулентности в граничном слое. Некоторые из первых попыток включали использование вращающихся навстречу концентрических цилиндров или дисков, ввод газовых пузырей, применение механических устройств и систем с пульсирующим потоком, т.е. с реверсом потока через мембрану. Многие системы испытывались в лабораториях, но не вышли на промышленный уровень.

Несколько лет назад на рынке, наконец, появились эффективные системы микрофильтрации, позволяющие регулировать давление пермеата и, тем самым, среднее трансмембранное давление, независимо от тангенциальной скорости. В частности, недавние разработки технологии керамических мембран позволили регулировать трансмембранное давление по всей поверхности мембраны, т.е. обеспечивать устойчивый оптимальный поток продукта. Этот успех основан на двух выдающихся достижениях – переменном сопротивлении слоя подложки мембраны и переменном сопротивлении активного слоя мембраны.

Эти достижения химии поверхностных свойств керамических мембран позволили изменять градиент для подавления образования гелевого слоя, что очень существенно для тонких процессов разделения, таких как извлечение ферментов.

Традиционные процессы микрофильтрации (рис. 4): Традиционная технология керамических мембран позволяет регулировать трансмембранное давление только на макроуровне, меняя давление исходной смеси и пермеата. Трансмембранное давление по длине элемента менялось в силу падения давления на элементе. Поскольку керамические элементы обычно работают при более высоких тангенциальных скоростях (до 6 м/с), чем полимерные системы, трансмембранное давление меняется весьма существенно, что приводит к быстрому образованию гелевого слоя на входе и снижает проницаемость. В средней части элемента поддерживается оптимальный режим, а на выходе скорость фильтрации недостаточна из-за низкого трансмембранного давления. Чем дальше от входа в элемент, тем меньшая часть мембраны участвует в фильтрации, поэтому гелевый слой формируется очень быстро, сокращая эффективно используемую длину мембраны.

Рисунок 4. Традиционный процесс микрофильтрации

Разные производители модифицировали системы или сами мембраны, пытаясь создать "мембраны с регулируемым градиентом", чтобы ограничить образование гелевого слоя и улучшить условия разделения. Управление градиентом на мембране позволяет поддерживать постоянную скорость фильтрации по всей длине элемента. Стабильное падение давление по длине элемента уменьшает концентрационную поляризацию, т.е. ширину граничного слоя.

Усовершенствованные керамические мембраны Два производителя керамических мембран разработали два разных решения, позволяющих ограничить градиент на мембране и тем самым уменьшить гелевый слой и повысить эффективность разделения. Оба способа ограничивают образование гелевого слоя посредством изменения градиента. Один из них основан на модификации слоя подложки мембраны, другой – на применении активного слоя переменной толщины.

Первый способ (рис. 5) использует слой подложки, пористость которого уменьшается по длине элемента, из-за чего гидравлическое сопротивление на входе возрастает, а на выходе уменьшается. Снижение сопротивления подложки по длине элемента помогает поддерживать равномерный расход пермеата по всей поверхности мембраны. Имеются примеры успешного промышленного применения таких мембран.

Рисунок 5. Слой подложки переменной структуры

Второй способ (рис. 6) поддержания равномерного падения давления на мембране основан на изменении толщины самой мембраны: чем дальше от входа, тем она тоньше. Уменьшение толщины мембраны уменьшает гидравлическое сопротивление по длине элемента, обеспечивая равномерную скорость фильтрации по всей поверхности мембраны. Этот тип мембран также доказал свою пригодность в промышленных условиях.

Рисунок 6. Разделительный слой переменной толщины

Оба этих способа позволяют поддерживать постоянный перепад давления на мембране, то есть, сравнительно постоянную скорость фильтрации по длине элемента. В условиях постоянной скорости фильтрации остается постоянной и толщина граничного слоя и, следовательно, проницаемость для целевого продукта.

Заключение

Далеко не во всех системах микрофильтрации целесообразно применять для лучшего извлечения промышленных ферментов мембраны с регулируемым градиентом. Как и при любом существенном изменении технологии, применимость керамических мембран для эффективного отделения клеток и извлечения ферментов необходимо проверить в лабораторных и пилотных испытаниях.

Кроме того, экономичность применения микрофильтрации в производстве ферментов зависит от множества местных условий. Тем не менее, микрофильтрация на керамических мембранах зарекомендовала себя как эффективное средство сбора биомассы, которое позволяет сократить издержки и сделать производство ферментов более экономичным.